[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Biologia molekularna ę wiczenia Zakład Wirusologii Warszawa 2008 Prowadz Ģ cy: ę wiczenie 1 dr Monika Radli ı ska ę wiczenie 2 dr Agnieszka Kwiatek ę wiczenie 3 mgr Maciej Łuczkiewicz, mgr Michał Lower ę wiczenie 4 dr Monika Adamczyk-Popławska 2 Metylaza EcoRI Endonukleza restrykcyjna EcoRI Brak ci ħ cia endonukleaz Ģ restrykcyjn Ģ EcoRI 3 Ę wiczenie 1 Enzymy restrykcyjne i rekombinacja DNA in vitro Zjawisko restrykcji – modyfikacji Zjawisko restrykcji i modyfikacji (RM) zostało po raz pierwszy opisane w latach pi ħę dziesi Ģ tych zeszłego wieku (Luria i Human, 1952; Bertani i Weigle, 1953). Zaobserwowano, Ň e namna Ň anie si ħ bakteriofagów bywa w pewnym stopniu hamowane w zale Ň no Ļ ci od rodzaju szczepu bakteryjnego podlegaj Ģ cego infekcji. Biochemiczne podło Ň e i enzymy odpowiedzialne za to zjawisko scharakteryzowali Arber i Dussiox (1962). W 1978r Werner Arber, Hamilton O. Smith i Daniel Nathans otrzymali Nagrod ħ Nobla w medycynie za odkrycie enzymów restrykcyjnych, które doprowadziło do rozkwitu technologii rekombinacji DNA. MTaz a CH 3 MTaz a CH 3 ENaz a ENaz a Chromosom prokariotyczny CH 3 ENaza MTaz a CH 3 fragmenty zdegradowanego fagowego DNA MTaz a Rys 1. Zjawisko restrykcji-modyfikacji. W systemie RM wyró Ň nia si ħ dwie aktywno Ļ ci enzymatyczne: restrykcyjn Ģ (ENaza, endonukleaza restrykcyjna) oraz modyfikuj Ģ c Ģ (MTaza, metylotransferaza DNA, metylaza DNA), które rozpoznaj Ģ w DNA t ħ sam Ģ , specyficzn Ģ sekwencj ħ . MTaza modyfikuje okre Ļ lon Ģ zasad ħ w sekwencji rozpoznawanej. Je Ļ li sekwencja docelowa nie jest zmetylowana, ENaza przeprowadza ci ħ cie endonukleolityczne DNA (Rys. 1 i 2). Zmodyfikowany genomowy DNA, w komórce posiadaj Ģ cej system RM, nie jest substratem dla ENaz. Natomiast obcy DNA (np. infekuj Ģ cego faga) zostaje rozpoznany przez ENaz ħ i strawiony. Mechanizm obronny komórek bakteryjnych przed obcym DNA np. bakteriofagowym jest główn Ģ postulowan Ģ funkcj Ģ systemów RM (Arber i Dussoix, 1962). Według innej hipotezy s Ģ one samolubnymi ruchomymi elementami genetycznymi, których utrzymanie w genomie jest warunkiem przetrwania - rodzaj systemu „trucizna-odtrutka” (Kobayashi, 2001). Sugeruje si ħ te Ň ich udział w utrzymywaniu to Ň samo Ļ ci gatunkowej bakterii (Jeltsch, 2003) oraz, Ň e przez indukowanie rearan Ň acji genomowych przyczyniaj Ģ si ħ do zró Ň nicowania genetycznego (Arber, 2000). 4 5’ – G Ř A A TTC – 3’ 3’ – CTT A A Ŗ G – 5’ CH 3 CH 3 Rys 2. Ta sama substratowa sekwencja w DNA dla endonukleazy restrykcyjnej i metylotransferazy DNA – ró Ň ne produkty reakcji przeprowadzanych przez te enzymy. Ze wzgl ħ du na ró Ň norodno Ļę i mnogo Ļę przedstawicieli ERaz oraz towarzysz Ģ cych im MTaz, zostały one podzielone na cztery typy (Roberts i wsp., 2003; Tabela 1). Do Typu I zaliczono kompleksy białkowe zło Ň one z trzech rodzajów podjednostek: rozpoznaj Ģ cych specyficzn Ģ sekwencj ħ (S), endonukleolitycznych (R) i modyfikacyjnych (M). Enzym do ci ħ cia wymaga obecno Ļ ci ATP. Sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna i składa si ħ z dwóch krótkich odcinków zasad o okre Ļ lonej specyficzno Ļ ci, przedzielonych kilkoma niespecyficznymi parami nukleotydów (np. EcoKI AACN 6 GTGC). Typ II stanowi najliczniejsz Ģ grup ħ , do niego zaliczamy systemy składaj Ģ ce si ħ najcz ħĻ ciej z dwóch oddzielnych białek: monomerycznej MTazy i dimerycznej ERazy. Sekwencja docelowa jest krótka (4 do 8 par zasad) i cz ħ sto palindromiczna. Typ III systemów RM obejmuje układ składaj Ģ cy si ħ z dwóch rodzajów podjednostek modyfikacyjnej (M) i endonukleolitycznej (E). Miejsce rozpoznawane przez te enzymy jest niepalindromiczne o długo Ļ ci 5-6 par zasad, do ci ħ cia wymagane s Ģ jego dwie kopie, a tak Ň e ATP. Natomiast do Typu IV zaliczono ERazy, które trawi Ģ tylko zmetylowan Ģ ni ę DNA. Tabela 1. Najwa Ň niejsze charakterystyczne cechy ró Ň nych typów enzymów restrykcyjnych i metylaz DNA. Cecha Typ I TypII TypIII TypIV Podjednostki strukturalne Trzy Dwie Dwie Dwie (lub jedna) Aktywno Ļę enzymatyczna Endonukleaza Metylotransferaza ATPaza Endonukleaza Metylotransferaza Endonukleaza Metylotransferaza ATPaza Endonukleaza GTPaza Kofaktory niezb ħ dne do ci ħ cia ATP AdoMet Mg 2+ Mg 2 ATP C (ATP) GTP AdoMet Mg 2 Kofaktory niezb ħ dne do metylacji DNA ATP AdoMet Mg 2 AdoMet AdoMet Mg 2 - Rozpoznawana sekwencja Asymetryczna dwucz ħĻ ciowa Zwykle symetryczna Asymetryczna Dwucz ħĻ ciowa zmetylowana Miejsce ci ħ cia Losowe, co najmniej 1000pz od sekwencji rozpoznawanej W obr ħ bie, albo tu Ň obok sekwencji rozpoznawanej 25-27pz od miejsca rozpoznawanego W ró Ň nych miejscach pomi ħ dzy zmodyfikowanymi zasadami Translokacja DNA Tak Nie Tak Tak Typ I i III charakteryzuje brak Ļ cisłej kontroli nad poło Ň eniem miejsca ci ħ cia wzgl ħ dem rozpoznawanej sekwencji. Natomiast enzymy Typu II przecinaj Ģ DNA w sekwencji 5 [ Pobierz całość w formacie PDF ] |