[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Biologia molekularna
ę
wiczenia
Zakład Wirusologii
Warszawa 2008
Prowadz
Ģ
cy:
ę
wiczenie 1 dr Monika Radli
ı
ska
ę
wiczenie 2 dr Agnieszka Kwiatek
ę
wiczenie 3 mgr Maciej Łuczkiewicz,
mgr Michał Lower
ę
wiczenie 4 dr Monika Adamczyk-Popławska
2
Metylaza EcoRI
Endonukleza restrykcyjna EcoRI
Brak ci
ħ
cia endonukleaz
Ģ
restrykcyjn
Ģ
EcoRI
3
Ę
wiczenie 1
Enzymy restrykcyjne i rekombinacja DNA
in vitro
Zjawisko restrykcji – modyfikacji
Zjawisko restrykcji i modyfikacji (RM) zostało po raz pierwszy opisane w latach
pi
ħę
dziesi
Ģ
tych zeszłego wieku (Luria i Human, 1952; Bertani i Weigle, 1953). Zaobserwowano,
Ň
e namna
Ň
anie si
ħ
bakteriofagów bywa w pewnym stopniu hamowane w zale
Ň
no
Ļ
ci od rodzaju
szczepu bakteryjnego podlegaj
Ģ
cego infekcji. Biochemiczne podło
Ň
e i enzymy odpowiedzialne
za to zjawisko scharakteryzowali Arber i Dussiox (1962). W 1978r Werner Arber, Hamilton O.
Smith i Daniel Nathans otrzymali Nagrod
ħ
Nobla w medycynie za odkrycie enzymów
restrykcyjnych, które doprowadziło do rozkwitu technologii rekombinacji DNA.
MTaz
a
CH
3
MTaz
a
CH
3
ENaz
a
ENaz
a
Chromosom
prokariotyczny
CH
3
ENaza
MTaz
a
CH
3
fragmenty
zdegradowanego
fagowego DNA
MTaz
a
Rys 1. Zjawisko restrykcji-modyfikacji.
W systemie RM wyró
Ň
nia si
ħ
dwie aktywno
Ļ
ci enzymatyczne: restrykcyjn
Ģ
(ENaza,
endonukleaza restrykcyjna) oraz modyfikuj
Ģ
c
Ģ
(MTaza, metylotransferaza DNA, metylaza
DNA), które rozpoznaj
Ģ
w DNA t
ħ
sam
Ģ
, specyficzn
Ģ
sekwencj
ħ
. MTaza modyfikuje okre
Ļ
lon
Ģ
zasad
ħ
w sekwencji rozpoznawanej. Je
Ļ
li sekwencja docelowa nie jest zmetylowana, ENaza
przeprowadza ci
ħ
cie endonukleolityczne DNA (Rys. 1 i 2).
Zmodyfikowany genomowy DNA, w komórce posiadaj
Ģ
cej system RM, nie jest substratem
dla ENaz. Natomiast obcy DNA (np. infekuj
Ģ
cego faga) zostaje rozpoznany przez ENaz
ħ
i
strawiony. Mechanizm obronny komórek bakteryjnych przed obcym DNA np. bakteriofagowym
jest główn
Ģ
postulowan
Ģ
funkcj
Ģ
systemów RM (Arber i Dussoix, 1962). Według innej hipotezy
s
Ģ
one samolubnymi ruchomymi elementami genetycznymi, których utrzymanie w genomie jest
warunkiem przetrwania - rodzaj systemu „trucizna-odtrutka” (Kobayashi, 2001). Sugeruje si
ħ
te
Ň
ich udział w utrzymywaniu to
Ň
samo
Ļ
ci gatunkowej bakterii (Jeltsch, 2003) oraz,
Ň
e przez
indukowanie rearan
Ň
acji genomowych przyczyniaj
Ģ
si
ħ
do zró
Ň
nicowania genetycznego (Arber,
2000).
4
5’ – G
Ř
A
A
TTC – 3’
3’ – CTT
A
A
Ŗ
G – 5’
CH
3
CH
3
Rys 2. Ta sama substratowa sekwencja w DNA dla endonukleazy restrykcyjnej i metylotransferazy DNA –

Ň
ne produkty reakcji przeprowadzanych przez te enzymy.
Ze wzgl
ħ
du na ró
Ň
norodno
Ļę
i mnogo
Ļę
przedstawicieli ERaz oraz towarzysz
Ģ
cych im
MTaz, zostały one podzielone na cztery typy (Roberts i wsp., 2003; Tabela 1). Do Typu I
zaliczono kompleksy białkowe zło
Ň
one z trzech rodzajów podjednostek: rozpoznaj
Ģ
cych
specyficzn
Ģ
sekwencj
ħ
(S), endonukleolitycznych (R) i modyfikacyjnych (M). Enzym do ci
ħ
cia
wymaga obecno
Ļ
ci ATP. Sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna i składa si
ħ
z dwóch
krótkich odcinków zasad o okre
Ļ
lonej specyficzno
Ļ
ci, przedzielonych kilkoma niespecyficznymi
parami nukleotydów (np. EcoKI AACN
6
GTGC). Typ II stanowi najliczniejsz
Ģ
grup
ħ
, do niego
zaliczamy systemy składaj
Ģ
ce si
ħ
najcz
ħĻ
ciej z dwóch oddzielnych białek: monomerycznej
MTazy i dimerycznej ERazy. Sekwencja docelowa jest krótka (4 do 8 par zasad) i cz
ħ
sto
palindromiczna. Typ III systemów RM obejmuje układ składaj
Ģ
cy si
ħ
z dwóch rodzajów
podjednostek modyfikacyjnej (M) i endonukleolitycznej (E). Miejsce rozpoznawane przez te
enzymy jest niepalindromiczne o długo
Ļ
ci 5-6 par zasad, do ci
ħ
cia wymagane s
Ģ
jego dwie
kopie, a tak
Ň
e ATP. Natomiast do Typu IV zaliczono ERazy, które trawi
Ģ
tylko zmetylowan
Ģ
ni
ę
DNA.
Tabela 1. Najwa
Ň
niejsze charakterystyczne cechy ró
Ň
nych typów enzymów restrykcyjnych i metylaz DNA.
Cecha
Typ I
TypII
TypIII
TypIV
Podjednostki
strukturalne
Trzy
Dwie
Dwie
Dwie (lub jedna)
Aktywno
Ļę
enzymatyczna
Endonukleaza
Metylotransferaza
ATPaza
Endonukleaza
Metylotransferaza
Endonukleaza
Metylotransferaza
ATPaza
Endonukleaza
GTPaza
Kofaktory
niezb
ħ
dne do ci
ħ
cia
ATP
AdoMet
Mg
2+
Mg
2
ATP
C
(ATP)
GTP
AdoMet
Mg
2
Kofaktory
niezb
ħ
dne do
metylacji DNA
ATP
AdoMet
Mg
2
AdoMet
AdoMet
Mg
2
-
Rozpoznawana
sekwencja
Asymetryczna
dwucz
ħĻ
ciowa
Zwykle
symetryczna
Asymetryczna
Dwucz
ħĻ
ciowa
zmetylowana
Miejsce ci
ħ
cia
Losowe, co
najmniej 1000pz od
sekwencji
rozpoznawanej
W obr
ħ
bie, albo
tu
Ň
obok
sekwencji
rozpoznawanej
25-27pz od
miejsca
rozpoznawanego
W ró
Ň
nych
miejscach pomi
ħ
dzy
zmodyfikowanymi
zasadami
Translokacja DNA
Tak
Nie
Tak
Tak
Typ I i III charakteryzuje brak
Ļ
cisłej kontroli nad poło
Ň
eniem miejsca ci
ħ
cia wzgl
ħ
dem
rozpoznawanej sekwencji. Natomiast enzymy Typu II przecinaj
Ģ
DNA w sekwencji
5
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
  • zanotowane.pl
  • doc.pisz.pl
  • pdf.pisz.pl
  • zawrat.opx.pl
  • Archiwum
    Powered by wordpress | Theme: simpletex | © Nie można obronić się przed samym sobą.